系統性硬化癥（SSc）患者通常表現為皮膚纖維化，也可延伸至內臟器官。纖維化是由于細胞外基質（ECM）蛋白（如纖連蛋白和膠原蛋白）的過度沉積，主要由活化的成纖維細胞產生，導致組織結構破壞、器官功能障礙及器官衰竭。漿細胞樣樹突狀細胞（pDCs）是先天免疫細胞，專門產生大量 I 型干擾素（IFN），這與 SSc 有關。事實上，pDCs 在 SSc 患者的受累組織中積累，研究表明，小鼠模型中 pDCs 的消耗可改善纖維化。此外，激活的 pDCs 通過持續(xù)產生 IFN-α 導致 SSc 中 I 型 IFN 水平的升高。

不同的生理條件，特別是當對蛋白質合成和折疊有很高的需求時，可能會促進內質網（ER）應激。在未折疊和錯誤折疊的蛋白質積累后，免疫球蛋白重鏈結合蛋白（BiP）與 ER 應激傳感器——蛋白激酶R 樣ER 激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和激活轉錄因子6（ATF6）——解離，未折疊蛋白反應（UPR）被啟動以支持 ER 穩(wěn)態(tài)。枯草桿菌酶細胞毒素 SubAB 是一種由產志賀毒素大腸桿菌（STEC）菌株產生的 AB5 毒素，通過裂解 BiP 誘導 ER 應激。用藥物誘導劑促進人肺成纖維細胞的 ER 應激可上調膠原蛋白和成纖維細胞活化標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的產生。

據報道，ER 應激標志物在 SSc 中上調，重要的是，在 SSc 患者分離的循環(huán) pDCs 中觀察到 ER 應激信號通路失調。盡管最近的研究將 pDCs、ER 應激和 SSc 聯系起來，但它們在纖維化中作用的確切機制仍不清楚。鑒于 pDCs 和成纖維細胞可能在受影響的組織中相互作用，因此，葡萄牙阿威羅大學生物醫(yī)學研究所及澳大利亞阿德萊德大學分子與生物醫(yī)學系研究團隊探討了 ER 應激對 pDCs 和成纖維細胞共培養(yǎng)的影響。研究成果發(fā)表于 Cell Communication and Signaling 期刊題為“Promoting ER stress in a plasmacytoid dendritic cell line drives fibroblast activation”。

首先，為了研究 pDCs 對成纖維細胞行為的影響，建立了 CAL-1 細胞、pDC 細胞系和 IMR-90 肺成纖維細胞的體外共培養(yǎng)模型，觀察到 CAL-1 細胞與成纖維細胞形成偶聯物，經過幾個洗滌步驟后不易脫落（圖1 A ）。當比較共培養(yǎng)物與單獨培養(yǎng)的 IMR-90 和 CAL-1 細胞組合的對照中不同 ECM 成分的量時，觀察到 α-SMA 的蛋白質和 mRNA 水平均降低，I 型膠原 mRNA 水平也有所降低，這可能是由于共培養(yǎng)中 CAL-1 和 IMR-90 細胞之間的生長速率存在差異，從而可能會影響細胞：細胞比例，同時降低產生 α-SMA 的細胞比例。

為了測試 pDC 激活是否會影響成纖維細胞活化，將 IMR-90-CAL-1 與 Toll 樣受體7（TLR7）激動劑 CL307 共培養(yǎng)，其促進 CAL-1 細胞分泌 IFN-β，結果觀察到，IMR-90 細胞單一培養(yǎng)和 IMR-90-CAL-1 細胞共培養(yǎng)在用 CL307 處理后均未表現出纖連蛋白或 α-SMA 表達的改變（圖1 B）。

為了測試 ER 應激對共培養(yǎng)物的影響，用 SubAB 處理細胞。正如預期，SubAB 處理在單獨培養(yǎng)的 IMR90 細胞和 IMR-90-CAL-1 細胞共培養(yǎng)中誘導了 UPR 激活，GADD34 水平升高證實了這一點。GADD34 在激活的 ER 應激傳感器 PERK 的下游產生，并作為負反饋蛋白，以減弱 UPR 信號傳導。SubAB 處理單獨培養(yǎng)的 IMR-90 成纖維細胞導致纖連蛋白水平增加，而不影響 α-SMA，并降低 I 型膠原 mRNA 水平。單獨培養(yǎng)的 CAL-1 細胞不表達纖連蛋白、α-SMA 和 I 型膠原蛋白。然而，最重要的是，將 SubAB 添加到 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物中促進了纖連蛋白和 α-SMA 在蛋白質和 mRNA 水平上的產生。

因此，SubAB 誘導的 ER 應激與 CAL-1 細胞的存在相結合，促進纖連蛋白的產生和成纖維細胞活化，這是纖維化的兩個標志。

圖1 IMR-90 和 CAL-1 細胞在共培養(yǎng)中相互作用。

接下來，還測試了其他 ER 應激誘導劑的作用，即抑制蛋白質糖基化的衣霉素（Tm）和 BiP 抑制劑 HA15。出乎意料的是，Tm 處理在共培養(yǎng)和 IMR-90 單一培養(yǎng)中分別誘導了纖連蛋白和 α-SMA 蛋白水平的降低（圖2 A）。通過分析 Tm 處理 6 小時后 PERK 和 eIF2α 的磷酸化以及 GAD34 的上調證實了 IMR-90 和 CAL-1 細胞中的 ER 應激誘導。另一方面，HA15 以更像 SubAB 的方式影響直接共培養(yǎng)，上調纖連蛋白和 α-SMA 蛋白水平（圖2 B）。然而，HA15 并未促進纖連蛋白在單一培養(yǎng)的 IMR-90 細胞中的積累，盡管 GADD34 在孵育3 天后上調（圖2 B）。

之前已經觀察到，pDC 暴露于 SubAB 會觸發(fā) PERK 和 IFN 基因刺激因子（STING）的激活，這是誘導 pDC 激活的關鍵。因此，為了闡明 CAL-1 細胞 PERK 和 STING 表達的作用，直接將 IMR-90 與 Sting1−/− 或 Perk/EIF2AK3−/− CAL-1 細胞共培養(yǎng)（圖2 C ）。雖然 STING 的缺失不會影響纖連蛋白的表達，但 PERK 的缺失消除了 SubAB 處理的共培養(yǎng)物中纖連蛋白和 α-SMA 表達的上調（圖2 C）。

這些結果表明，在 CAL-1 細胞中，BiP 抑制/降解和隨之而來的 UPR 誘導，特別是 PERK 通路，促進了 CAL-1 和 IMR-90 細胞共培養(yǎng)物中纖連蛋白和 α-SMA 的產生。

圖2 BiP 抑制/耗竭和 PERK 激活影響 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物中纖連蛋白和 α-SMA 的表達。

TGF-β1 是一種眾所周知的促纖維化因子，通過與 TGF-β 受體2 結合直接激活成纖維細胞，誘導 ECM 的產生，還可以調節(jié)免疫細胞功能。為了闡明 SubAB 誘導的作用是否伴隨著 TGF-β1 上調，分析了其在細胞培養(yǎng)基中的 mRNA 表達和蛋白質水平，發(fā)現 SubAB 沒有誘導 TGF-β1 表達，但其分泌水平降低，這可能是由于 PERK 激活下游的蛋白質合成抑制（圖3 B）。因此，SubAB 處理的共培養(yǎng)物中的成纖維細胞活化不受 TGF-β1 驅動。

為了測試成纖維細胞活化是否可以由細胞分泌的其他因子介導，將 IMR-90 成纖維細胞與來自 CAL-1 或 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物的 CM 一起孵育（圖3 B）。結果觀察到，與各自的對照相比，用 SubAB 處理的來自 CAL-1 單獨培養(yǎng)或直接共培養(yǎng)物的 CM 都不會促進 IMR-90 細胞中纖連蛋白或 α-SMA 的產生增加（圖3 C、D）。此外，在存在或不存在 SubAB 的情況下，將 IMR-90 成纖維細胞在下室中共培養(yǎng)，CAL-1 細胞或 IMR-90-CAL-1 共培養(yǎng)物置于上室（圖3 E），發(fā)現這兩種條件都沒有導致 IMR-90 α-SMA 的產生增加（圖3 F、G）。在 SubAB 條件下觀察到纖連蛋白水平略有增加，這更可能是由于添加到培養(yǎng)物中的 SubAB 的影響，GADD34 的存在證實了這一點（圖3 C、F）。這些結果表明，SubAB 處理的 CAL-1 細胞分泌的可溶性因子，無論是在單一培養(yǎng)中還是與 IMR-90 成纖維細胞接觸共培養(yǎng)中，都不足以促進成纖維細胞活化。

這些發(fā)現表明，ER 應激導致 CAL-1 以細胞間接觸依賴性方式促進 IMR-90 成纖維細胞的激活。

圖3 在 SubAB 誘導的 ER 應激期間，CAL-1 誘導的 IMR-90 激活依賴于細胞間接觸。

總體而言，該研究發(fā)現，ER 應激激活的 CAL-1 細胞可以通過直接接觸成纖維細胞（纖維化的核心關鍵參與者之一）觸發(fā) ECM 產生和 IMR-90 成纖維細胞活化。因此，這項工作揭示了 pDCs 可能導致纖維化的機制，這有助于理解纖維化過程，并為纖維化疾病的創(chuàng)新方法的開發(fā)開辟新的前景，特別是對于 SSc。

參考文獻：Ferreira BH, Silva IS, Mendes A, Leite-Pinheiro F, Paton AW, Paton JC, Duarte IF, Pierre P, Almeida CR. Promoting ER stress in a plasmacytoid dendritic cell line drives fibroblast activation. Cell Commun Signal. 2025 Feb 7;23(1):66. doi: 10.1186/s12964-025-02057-7. PMID: 39920698; PMCID: PMC11804055.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39920698/

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